SiNAPSA, Monday, 27. May 2024

eSiNAPSA

Spletna revija za znanstvenike, strokovnjake
in nevroznanstvene navdušence

Fosforilacija 526Tyr proteina FUS spremeni njegovo jedrno-citoplazemsko razporeditev pri FTLD-FUS obolenju

Helena Motaln, Boris Rogelj

Raziskovalci iz Slovenije smo v povezavi z nevropatologi iz Nemčije in Nizozemske v članku, objavljenem v ugledni reviji Brain, okarakterizirali post-translacijsko modifikacijo (spremembo) – fosforilacijo proteina FUS na zadnjem C-terminalnem aminokislinskem ostanku, ki je udeležena pri zgodnjem razvoju obolenja frontotemporalne lobularne demence (FTLD). Izsledki raziskave omogočajo nov pomemben vpogled v vzroke nastanka FTLD in razvoj novih strategij za zdravljenje te bolezni.

RNA-vezavni protein FUS: gradnik agregatov pri nevrodegenerativnih obolenjih

Za nevrodegenerativne bolezni, kot je demenca, je značilno odmiranje živčnih celic. V možganih teh bolnikov prihaja do nenormalnega kopičenja nekaterih proteinov na napačni subcelični lokaciji (citoplazmi) v živčnih celicah, kar vodi v njihovo smrt. Do kopičenja teh proteinov pride zaradi sprememb, ki se zgodijo v proizvodnji teh proteinov, pri njihovem razporejanju, agregaciji in razgradnji. Z različnimi genomskimi pristopi so bile odkrite mutacije v genih številnih RNA-vezavnih proteinov (RBP), ki so povezani s patogenezo dveh prekrivajočih, klinično heterogenih nevrodegenerativnih bolezni, amiotrofično lateralno sklerozo (ALS) in frontotemporalno lobularno degeneracijo (FTLD) 1 2 3 4 5. V skupino RNA-vezavnih proteinov spada tudi protein FUS (angl. Fused in sarcoma), katerega toksične agregate najdemo pri ALS in FTLD. Ker zanj velja, da mutacije v genu Fus najdemo le v podskupini primerov ALS, pri FTLD pa jih ni zaslediti, je iz tega moč sklepati, da najbrž mutacije pri FUS ne predstavljajo neposrednega vzroka za razvoj FTLD 6 7 8. To poraja vprašanje, kakšen je torej molekularni mehanizem, ki uravnava napačno lokalizacijo in agregacijo citoplazemskega protein FUS pri FTLD. Prisotnost toksičnih citoplazemskih vključkov proteina FUS v primerih fALS-FUS in FTLD-FUS sicer namiguje na številne mehanizme oziroma njihove kombinacije, ki izhajajo iz izgube funkcije proteina oziroma njegove pridobljene toksičnosti, ki ju povzroča jedrno pomanjkanje proteina FUS oziroma njegova povečana pojavnost v citoplazmi 10 11 12 13. Za popolno razumevanje FUS patofiziologije, pa je nujno razjasniti signalne poti, ki uravnavajo njegovo jedrno-citoplazemsko razporejanje. Spremembe v sintezi in razgradnji proteina FUS, ki vplivajo na njegovo nepravilno kopičenje in agregacijo, poleg mutacij lahko povzročajo tudi post-translacijske modifikacije, ki dokazano vplivajo na fazno ločevanje (angl. Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS) in agregabilnost proteina FUS 14 15 16. Znana post-translacijska modifikacija proteina FUS je fosforilacija njegove zadnje aminokisline tirozin (FUSp-Y526). Za slednjo je bilo v preteklosti dokazano, da onemogoča normalno prehajanje proteina FUS v jedro živčnih celic 17. S tem pospeši njegovo nepravilno kopičenje izven jedra v citoplazmi telesa in odrastkov živčnih celic, kjer zaradi povišane koncentracije protein FUS agregira in tvori netopne toksične vključke, ki vodijo v smrt živčne celice 10 11 12.

Slika 1
Slika 1: Fosforiliran FUSp-Tyr526 se pri FTLD-FUS obolenju nahaja v povečani meri v jedru nevronov in v atipičnih agregatih v njihovi citoplazmi.


Aktivacija kinaz iz družine Src uravnava fosforilacijo 526Tyr FUS

V raziskavi smo želeli razjasniti mehanizem fosforilacije 526Tyr FUS (FUSp-Y526) in njegov vpliv na jedrno-citoplazemsko razporejanje proteina FUS. V preteklosti smo pokazali, da fosforilacija 526Tyr FUS poveča njegovo citoplazemsko lokalizacijo zaradi inhibirane vezave proteina FUS na jedrni prenašalec TNPO1 17 18 19. Za vpogled v mehanizem fosforilacije Tyr526 FUS smo analizirali vpliv različnih kinaz povezanih s stresom in ALS/FTLD 20 21 22. Sintetizirali in karakterizirani smo specifični detektor (protitelo) za modificirano zadnjo aminokislino (pTyr526) proteina FUS in z napredno mikroskopijo analizirali vzorec razporejanja topnega in netopnega proteina FUSp-Tyr526 v celicah, ki ga komercialno dostopni detektorji ne zaznajo. Dokazali smo, da kar tri kinaze Src, Fyn in Abl fosforilirajo Tyr526 FUS 17. Ker so kinaze Src-družine aktivne tudi v možganih 22, smo raziskali vzorec so-pojavljanja FUSp-Y526 in aktivnih kinaz (pSrc, pFyn, pAbl) v različnih nevronom podobnih diferenciranih celičnih modelih (NSC34, SH-SY5Y), v kultiviranih primarnih kortikalnih nevronih miši in v mišjih možganih, ter ga primerjali z vzorcem pojavljanja FUSp-Y526 in aktivnih kinaz v piramidalnih nevronih čelne skorje možganov bolnikov s FTLD-FUS. Prekrivanje signalov fosforiliranega FUSp-Tyr526 in različnih kinaz je razkrilo odvisnost subcelične lokalizacije FUSp-Y526 od tipa kinaz v celičnih modelih in mišjih možganih. Bistveno spremenjeno jedrno-citoplazemsko razporejanje FUSp-Y526 pa je bilo opaziti v možganih bolnikov s FTLD-FUS v primerjavi z možgani nevrološko normalnih kontrol. Čeprav je bilo v večini kortikalnih nevronov bolnikov s FTLD-FUS opaziti difuzen citoplazemski in srednje do močan jedrni FUSp-Y526 signal, je kar 10–20 % teh kortikalnih nevronov posedovalo tudi majhne atipične zrnate citoplazemske FUSp-Y526 pozitivne vključke. Ti mali zrnati FUSp-Y526 pozitivni agregati, se morfološko razlikujejo od velikih tipičnih globularnih agregatov FUS, ki so zelo redko pozitivni na FUSp-Y526. V skladu s splošnim prepričanjem, da morda zorenje stresnih granul uravnava tvorbo teh večjih agregatov FUS, smo potrdili, da v pogojih oksidativnega stresa kinaza Abl pospeši privzem FUSp-Y526 v G3BP1-pozitivne stresne granule v nevronom podobnih celicah. Čeprav bo šele prihodnja podrobna analiza teh netipičnih zrnatih akumulacij FUSp-Y526 razkrila njihovo natančno vlogo v patologiji FUS-a, pa na podlagi teh rezultatov domnevamo, da so zrnate akumulacije FUSp-Y526 najbrž patološko aktivni predhodniki večjih toksičnih agregatov FUS.

Zaključek

FUSp-Y526 najverjetneje uravnava agregacijo proteina FUS v živčnih celicah pod stresnimi pogoji, ko pride do aktivacije kinaze Abl, ki pospeši privzem modificiranega proteina FUSp-Y526 v netipične agregate oziroma stresne granule, ki prispevajo k zgodnji patologiji FTLD-FUS. Novo razvita protitelesa predstavljajo edinstveno platformo za detekcijo fosforilacije na C-terminalnem 526Tyr FUS, bodisi v jedru ali v citoplazmi; in za analizo interakcij FUSp-Y526 z drugimi oblikami FUS in RBP, ki tvorijo agregate pri FTLD in ostalih FUSopatijah. Aktivacijo kinaze Abl v stresnih pogojih ter njeno vlogo pri spremenjenem razporejanju proteina FUS v nevronih, podajamo kot nov osnovni mehanizem nastanka in napredovanja FUS-FTLD obolenja. Kontrola tega mehanizma bo omogočila preživetje živčnih celic.

    ___
  1. Kwiatkowski TJJ, Bosco DA, Leclerc AL, Tamrazian E, Vanderburg CR, Russ C, Davis A, Gilchrist J, Kasarskis E, Munsat T, Valdmanis P, Rouleau GA, Hosler V, Cortelli P, de Jong PJ, Yoshinaga Y, Haines JL, Pericak-Vance MA, Yan J, Ticozzi N, Siddique T, McKenna-Yasek D, Sapp PC, Horvitz HR, Landers JE, Brown RH. Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophic lateral sclerosis. Science. 2009;323(5918):1205-1208. doi:10.1126/science.1166066 

  2. Vance C, Rogelj B, Hortobágyi T, De Vos KJ, Nishimura AL, Sreedharan J, Hu X, Smith B, Ruddy D, Wright P, Ganesalingam J, Williams KL, Tripathi V, Al-Saraj S, Al-Chalabi A, Leigh PN, Blair IP, Nicholson G, de Belleroche J, Gallo JM, Miller CC, Shaw CE. Mutations in FUS, an RNA processing protein, cause familial amyotrophic lateral sclerosis type 6. Science. 2009;323(5918):1208-1211. doi:10.1126/science.1165942 

  3. Cairns NJ, Ghoshal N. FUS: A new actor on the frontotemporal lobar degeneration stage. Neurology. 2010;74(5):354-356. doi:10.1212/WNL.0b013e3181ce5dd6 

  4. Prpar Mihevc S, Darovic S, Kovanda A, Bajc Česnik A, Župunski V, Rogelj B. Nuclear trafficking in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. Brain. 2017;140(1):13-26. doi:10.1093/brain/aww197 

  5. Rogelj B, Easton LE, Bogu GK, Stanton LW, Rot G, Curk T, Zupan B, Sugimoto Y, Modic M, Haberman N, Tollervey J, Fujii R, Takumi T, Shaw CE, Ule J. Widespread binding of FUS along nascent RNA regulates alternative splicing in the brain. Sci Rep. 2012;2:603. doi:10.1038/srep00603 

  6. Snowden JS, Hu Q, Rollinson S, Halliwell N, Robinson A, Davidson YS, Momeni P, Baborie A, Griffiths TD, Jaros E, Perry RH, Richardson A, Pickering-Brown SM, Neary D, Mann DMA. The most common type of FTLD-FUS (aFTLD-U) is associated with a distinct clinical form of frontotemporal dementia but is not related to mutations in the FUS gene. Acta Neuropathol. 2011;122(1):99-110. doi:10.1007/s00401-011-0816-0 

  7. Rhine K, Makurath MA, Liu J, Skanchy S, Lopez C, Catalan KF, Ma Y, Fare CM, Shorter J, Ha T, Chemla YR, Myong S. ALS/FTLD-Linked Mutations in FUS Glycine Residues Cause Accelerated Gelation and Reduced Interactions with Wild-Type FUS. Mol Cell. 2020;80(4):666-681.e8. doi:10.1016/j.molcel.2020.10.014 

  8. Naumann M, Laubenthal J, Hermann A. Fused in sarcoma-amyotrophic lateral sclerosis as a novel member of DNA single strand break diseases with pure neurological phenotypes. Neural Regen Res. 2021;16(1):110-112. doi:10.4103/1673-5374.286963 

  9. Lysikova EA, Kukharsky MS, Chaprov KD, Vasilieva NA, Roman AY, Ovchinnikov RK, Deykin AV, Ninkina N, Buchman VL. Behavioural impairments in mice of a novel FUS transgenic line recapitulate features of frontotemporal lobar degeneration. Genes Brain Behav. 2019;18(8):e12607. doi:10.1111/gbb.12607 

  10. Lysikova EA, Funikov S, Rezvykh AP, Chaprov KD, Kukharsky MS, Ustyugov A, Deykin AV, Flyamer IM, Boyle S, Bachurin SO, Ninkina N, Buchman VL. Low Level of Expression of C-Terminally Truncated Human FUS Causes Extensive Changes in the Spinal Cord Transcriptome of Asymptomatic Transgenic Mice. Neurochem Res. 2020;45(5):1168-1179. doi:10.1007/s11064-020-02999-z 

  11. Shelkovnikova TA, Peters OM, Deykin AV, Connor-Robsob N, Robson H, Ustyugov AA, Bachurin SO, Ermolkevich TG, Goldman IL, Sadchikova ER, Kovrazhkina EA, Skvortsova VI, Ling SC, Da Cruz S, Parone PA, Buchman VL, Ninkina NN. Fused in sarcoma (FUS) protein lacking nuclear localization signal (NLS) and major RNA binding motifs triggers proteinopathy and severe motor phenotype in transgenic mice. J Biol Chem. 2013;288(35):25266-25274. doi:10.1074/jbc.M113.492017 

  12. Mitchell JC, McGoldrick P, Vance C, Hortobagyi T, Sreedharan J, Rogelj B, Tudor EL, Smith BN, Klasen C, Miller CCJ, Cooper JD, Greensmith L, Shaw CE. Overexpression of human wild-type FUS causes progressive motor neuron degeneration in an age- and dose-dependent fashion. Acta Neuropathol. 2013;125(2):273-288. doi:10.1007/s00401-012-1043-z 

  13. Kang J, Lim L, Song J. ATP enhances at low concentrations but dissolves at high concentrations liquid-liquid phase separation (LLPS) of ALS/FTD-causing FUS. Biochem Biophys Res Commun. 2018;504(2):545-551. doi:10.1016/j.bbrc.2018.09.014 

  14. Shorter J. Liquidizing FUS via prion-like domain phosphorylation. EMBO J. 2017;36(20):2925-2927. doi:10.15252/embj.201798078 

  15. Ikenaka K, Ishigaki S, Iguchi Y, Kawai K, Fujioka Y, Yokoi S, Abdelhamid RF, Nagano S, Mochizuki H, Katsuno M, Sobue G. Characteristic Features of FUS Inclusions in Spinal Motor Neurons of Sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 2020;79(4):370-377. doi:10.1093/jnen/nlaa003 

  16. Darovic S, Prpar Mihevc S, Župunski V, Gunčar G, Štalekar M, Lee YB, Shaw CE, Rogelj B. Phosphorylation of C-terminal tyrosine residue 526 in FUS impairs its nuclear import. J Cell Sci. 2015;128(22):4151-4159. doi:10.1242/jcs.176602 

  17. Yoshizawa T, Ali E, Jiou J, Fung HYJ, Burke KA, Kim SJ, Lin Y, Peeples WB, Saltzberg D, Soniat M, Baumhardt JM, Oldenbourg R, Sali A, Fawzi NL, Rosen MK, Chook YM. Nuclear Import Receptor Inhibits Phase Separation of FUS through Binding to Multiple Sites. Cell. 2018;173(3):693-705.e22. doi:10.1016/j.cell.2018.03.003 

  18. Guo L, Kim HJ, Wang H, Monaghan J, Freyermuth F, Sung JC, O’Donovan K, Fare CM, Diaz Z, Singh N, Zhang ZC, Coughlin M, Sweeny EA, DeSantis ME, Jackrel ME, Rodell CB, Burdick JA, King OD, Gitler AD, Lagier-Tourenne C, Pandey UB, Chook YM, Taylor JP, Shorter J. Nuclear-Import Receptors Reverse Aberrant Phase Transitions of RNA-Binding Proteins with Prion-like Domains. Cell. 2018;173(3):677-692.e20. doi:10.1016/j.cell.2018.03.002 

  19. Palomo V, Nozal V, Rojas-Prats E, Gil C, Martinez A. Protein kinase inhibitors for amyotrophic lateral sclerosis therapy. Br J Pharmacol. 2021;178(6):1316-1335. doi:10.1111/bph.15221 

  20. Ko HS, Lee Y, Shin JH, Karuppagounder SS, Gadad BS, Koleske AJ, Pletnikova O, Troncoso JC, Dawson VL, Dawson TM. Phosphorylation by the c-Abl protein tyrosine kinase inhibits parkin’s ubiquitination and protective function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(38):16691-16696. doi:10.1073/pnas.1006083107 

  21. Owen I, Rhoads S, Yee D, Wyne H, Gery K, Hannula I, Sendrum M, Shewmaker F. The prion-like domain of Fused in Sarcoma is phosphorylated by multiple kinases affecting liquid- and solid-phase transitions. Mol Biol Cell. 2020;31(23):2522-2536. doi:10.1091/mbc.E20-05-0290