Pri nekaterih nevrodegenerativnih boleznih in staranju opazimo v možganih spremembe (hipometabolizem), ki sovpadajo z zmanjšanim delovanjem noradrenergičnega sistema, ki uravnava možgansko presnovo. To lahko negativno vpliva na kognicijo (npr. učenje, pomnjenje). Naše raziskave na posameznih celicah, nevronih in gliji v možganih vinske mušice proučujejo vpliv staranja na oktopaminergično signalizacijo (analogno noradrenergični pri sesalcih) prek Ca²⁺ in cikličnega adenozin monofosfata (cAMP). Spremenjena signalizacija bi lahko vplivala na celično in s tem možgansko presnovo.

Vinska mušica kot modelni organizem

Vinska mušica (lat. Drosophila melanogaster) je nevretenčar iz skupine žuželk, ki je že od začetka 20. stoletja pomemben modelni organizem v bioznanosti ¹. Uporaba vinske mušice kot modelne živali ima številne prednosti, med katerimi so preprosto gojenje, kratek življenjski cikel, širok nabor orodij za genetsko manipulacijo, dostopnost številnih mutant in podatkovnih zbirk (npr. www.flybase.org) ter minimalne etične in varnostne zahteve za delo z gensko spremenjenimi organizmi tipa 1 ^{1 2}. Na podlagi raziskav na vinski mušici je bilo podeljenih kar šest Nobelovih nagrad za fiziologijo ali medicino, med drugim s področja genetike, razvojne biologije, prirojene imunosti, olfaktornega sistema in cirkadianega ritma ³.

Genoma vinske mušice in človeka sta si podobna v ~60 odstotkih in kar ~75 odstotkov genov, ki so povezani z boleznimi pri človeku, ima ortologe v vinski mušici ¹. Vinska mušica je zato pomembna za proučevanje temeljnih, evolucijsko ohranjenih življenjskih procesov tako v zdravju kot bolezni ². Raziskave na vinski mušici so ključne tudi za razumevanje delovanja živčnega sistema. Na modelu vinske mušice lahko med drugim proučujemo vpliv staranja na živčevje ⁴, razvoj nevrodegenerativnih bolezni, epilepsije, presnovnih motenj in rakavih obolenj živčevja ².

Osrednje živčevje odrasle vinske mušice: oktopaminergični vs. noradrenergični sistem

Vinska mušica spada v skupino žuželk, za katere je značilna popolna metamorfoza, zato se morfologija in organiziranost osrednjega živčevja med različnimi razvojnimi fazami lahko bistveno razlikujeta ⁵. Možgani/osrednje živčevje odrasle vinske mušice naj bi vsebovalo od ~90.000⁶ do ~150.000 ⁷ nevronov in ~15.000 celic glije ⁷, pri čemer so kljub nižji kompleksnosti v primerjavi z možgani sesalcev mnogi mehanizmi, kot je prenos informacij, ohranjeni ⁶. Celice glije imajo v osrednjem živčevju vinske mušice, podobno kot pri sesalcih, ključno vlogo pri vzdrževanju ionske in presnovne homeostaze, odstranjevanju nevrotransmitorjev, nevromodulaciji itd., pomembno pa prispevajo tudi k procesu staranja in nevrodegeneraciji ^{6 8}. V osrednjem živčevju jih razdelimo na pet podtipov: perinevrialna, subperinevrialna, korteksna, ovojna in astrocitou podobna glija oziroma astrociti ⁷. Zadnja ima podobne lastnosti in funkcije kot astrociti pri sesalcih ⁶.

Oktopaminergični sistem ima v vinski mušici podobno vlogo kot noradrenergični sistem v sesalcih. Ob aktivaciji se iz oktopaminergičnih nevronov vinske mušice izločata nevromodulatorja oktopamin in tiramin, analoga (nor)adrenalina pri sesalcih, ki uravnavata različne procese v osrednjem živčevju vinske mušice, kot so vzburjenje, pozornost, presnova, vedenje, cikel budnosti in spanja, učenje in tvorba spomina ⁹. Oktopamin in tiramin delujeta preko vezave na oktopaminske/tiraminske receptorje, ki so z G-proteini sklopljeni receptorji (GPCR), podobni adrenoceptorjem v sesalcih ¹⁰.

Pri sesalcih vezava noradrenalina, ki se primarno izloča iz noradrenergičnih nevronov iz jedra locus coeruleus v možganskem deblu, na adrenoceptorje aktivira znotrajcelične Ca Ca²⁺- in cAMP-signalne poti, kar aktivira presnovo celic ^{11 12}. V astrocitih, ki so pomembna tarča noradrenergične aktivacije, se akutno pospešijo privzem glukoze, razgradnja glikogena in aerobna glikoliza, ki vodi v nastanek laktata ¹³. Laktat se lahko ob povečani dejavnosti nevronov iz astrocitov prenese v nevrone, kjer služi kot energijski substrat, kar je ključno za vzdrževanje višjih kognitivnih funkcij ¹². Podobno vezava oktopamina in tiramina na oktopaminske/tiraminske receptorje sproži aktivacijo znotrajceličnih Ca Ca²⁺- in cAMP-signalnih poti pri nevretenčarjih ¹⁰ in morda vpliva na presnovo nevronov in/ali astrocitov ter s tem na kognicijo vinske mušice.

Noradrenergični sistem med staranjem in nevrodegeneracijo

Staranje možganov je povezano s strukturnimi spremembami možganskega tkiva (atrofija), upadom kognitivnih funkcij in gibalnih sposobnosti. Poleg tega je staranje eden glavnih dejavnikov tveganja za pojav nevrodegenerativnih bolezni, kot sta Alzheimerjeva in Parkinsonova bolezen ¹⁴. Učinkovite terapije za upočasnitev ali preprečitev kognitivnega staranja ni. S staranjem prebivalstva pa to postaja veliko zdravstveno in družbenoekonomsko breme razvitih držav, vključno s Slovenijo.

Med ključne znake staranja (in nevrodegeneracije) spada spremenjena možganska presnova, ki se med drugim kaže v zmanjšanem izkoriščanju glukoze (hipometabolizmu) ¹⁴. Zadnje je morda povezano z zmanjšanim delovanjem noradrenergičnega sistema, verjetno zaradi zmanjšanega števila noradrenergičnih nevronov ¹⁵, in lahko vodi do upada kognitivnih funkcij ¹⁶. Te spremembe se v možganih pojavijo že v zgodnjih fazah staranja in nevrodegenerativnih bolezni, še preden pride do kliničnih simptomov upada kognitivnih funkcij, in predstavljajo obetavno tarčo za razvoj novih zdravil. Ali se med staranjem spremeni noradrenergično signaliziranje, kar bi lahko prispevalo k spremenjeni presnovi in h kognitivnemu upadu, je slabo raziskano. Za preučevanje teh procesov smo uporabili vinsko mušico, ki je na področju raziskav staranja pomemben modelni organizem ⁴.

Proučevanje oktopaminergične signalizacije pri vinski mušici

Pri raziskavah z vinsko mušico je na voljo širok nabor orodij za genetsko manipulacijo, kot so binarni ekspresijski sistemi, ki omogočajo časovno in prostorsko ločeno uravnavanje izražanja genov v izbranih celičnih tipih/tkivih. Najpogosteje uporabljen je sistem Gal4-UAS ¹⁷. Z uporabo sistema Gal4-UAS smo tarčno izrazili gensko kodirajoče fluorescenčne nanosenzorje za Ca²⁺ (jGCaMP7b ¹⁸) in cAMP (Epac1-camps ¹⁹) v astrocitih in nevronih v možganih vinske mušice. To smo dosegli s križanjem promotorskih linij alrm-Gal4 in elav-Gal4, ki preko transkripcijskega dejavnika Gal4 aktivirata izražanje tarčnih genov specifično v astrocitih (alrm-Gal4) in nevronih (elav-Gal4), z linijama UAS-jGCaMP7b in UAS-Epac1-camps, ki nosita zapis za fluorescenčne nanosenzorje pod nadzorom aktivacijskega zaporedja UAS, na katerega se veže Gal4 (Slika 1). Možgane potomcev (generacija F1), izolirane iz mladih (do 5 dni starih) in staranih (>30 dni starih) vinskih mušic, smo nato izpostavili oktopaminu in spremljali znotrajcelične Ca²⁺- in cAMP-odzive v realnem času z uporabo konfokalne mikroskopije. Starane vinske mušice so imele v možganih vidne nevrodegenerativne spremembe in okrnjeno gibanje.

Slika 1: a) Shema križanja vinskih mušic. S pomočjo binarnega ekspresijskega sistema Gal4-UAS in celično-specifičnih promotorjev smo izrazili gensko kodirajoča nanosenzorja za Ca²⁺ (jGCaMP7b) in cAMP (Epac1-camps) v posameznem tipu možganskih celic, bodisi nevronu ali astrocitu. b) Reprezentativna fluorescenčna slika možganov vinske mušice (levo), ki v nevronih izraža gensko kodirajoči nanosenzor jGCaMP7b (zeleno) in fluorescenčni protein mCherry (magenta). Desni izsek prikazuje belo uokvirjeno območje slike levo pri večji povečavi (optični reženj) in povečavo posamezne celice (pikčasti krog). Merilo: 50 µm (levo), 20 µm (desno) in 5 μm (desno, izsek). c) Shematski prikaz sprememb v fluorescenčnih signalih jGCaMP7b (levo) in Epac1-camps (desno) v posamezni celici (nevronu), ki ponazarjajo spremembe v znotrajcelični koncentraciji Ca²⁺in cAMP po draženju možganov vinske mušice z oktopaminom. Ustvarjeno z BioRender. https://BioRender.com/i86j701

Oktopamin je v nevronih in astrocitih povzročil prehoden Ca²⁺- odziv, najverjetneje preko aktivacije oktopaminskih/tiraminskih receptorjev, sklopljenih z G_q-proteini, in mobilizacije Ca²⁺ iz znotrajceličnih zalog. Ca²⁺- odziv je bil izrazito močnejši v nevronih kot v astrocitih. Predvidevamo, da zaradi razlik v izražanju oktopaminskih/tiraminskih receptorjev in njihovih znotrajceličnih efektorjev med celičnimi tipi. Astrociti so se odzvali s porastom Ca²⁺ pri nižji koncentraciji oktopamina kot nevroni, kar kaže na njihovo večjo občutljivost za oktopaminergični dražljaj. Predhodni rezultati kažejo, da se je Ca²⁺- signalizacija, sprožena z oktopaminom, v nevronih in astrocitih v možganih staranih vinskih mušic močno zmanjšala. Oktopamin je sprožil tudi znotrajcelični cAMP-odziv, a le v nevronih, najverjetneje preko aktivacije z G_s-proteini sklopljenih receptorjev, na kar pa staranje ni imelo vpliva.

Z uporabo sistema Gal4-UAS in gensko kodirajočih fluorescenčnih nanosenzorjev za npr. glukozo, laktat, piruvat ²⁰ lahko v možganskih celicah vinske mušice spremljamo tudi možgansko presnovo med staranjem, kar bo predmet prihodnjih raziskav.

Zaključki

Naše raziskave so pokazale, da se signalizaciji prek znotrajceličnega Ca²⁺ in cAMP med nevroni in astrociti po aktivaciji možganov vinske mušice z oktopaminom razlikujeta. Ca²⁺- odziv nevronov na oktopaminergični dražljaj je bistveno močnejši kot v astrocitih. Kljub temu pa so astrociti tisti, ki se na dražljaj odzovejo že pri nizkih koncentracijah oktopamina, kar nakazuje na njihovo nevromodulatorno vlogo v možganih vinske mušice. cAMP-signalna pot se po oktopaminergičnem dražljaju aktivira samo v nevronih, ne pa v astrocitih, kar kaže na vlogo cAMP pri uravnavanju celičnih procesov predvsem v nevronih. Zaradi spremenjene Ca²⁺- signalizacije v nevronih in astrocitih v starajočih možganih bi lahko prišlo do motenj v celični presnovi in s tem kognitivnega upada. Spremenjena Ca²⁺- signalizacija bi lahko predstavljala novo tarčo za razvoj terapij, usmerjenih v obnovo možganske presnove in kognitivnih/gibalnih funkcij.

Zahvala: Raziskave je financirala Javna agencija za znanstvenoraziskovalno in inovacijsko dejavnost Republike Slovenije (P3 310, J3 50104, J3 60077).