Multipla skleroza je kronična vnetna bolezen osrednjega živčevja, za katero je značilna izguba mielina. Pri tej bolezni je remielinizacija pogosto neučinkovita, saj oligodendrociti ne dozorijo v funkcionalne mielinizirajoče celice ¹. V nedavni raziskavi smo pokazali, da glikolitični encim γ-enolaza spodbuja diferenciacijo oligodendrocitov, medtem ko lizosomska peptidaza katepsin X njeno delovanje zmanjšuje z encimsko razgradnjo. Ugotovitve razkrivajo nov mehanizem uravnavanja mielinske obnove in izpostavljajo potencialno terapevtsko tarčo za zdravljenje bolezni, povezanih z izgubo mielina.

Oligodendrociti so specializirane celice glije v osrednjem živčevju, ki tvorijo mielinski ovoj aksonov ter tako omogočajo hitro prevajanje živčnih impulzov in presnovno podporo aksonom ². Njihovo nastajanje iz oligodendrocitnih prekurzorskih celic (OPC) je dinamičen proces, ki vključuje številne signalne poti, preoblikovanje citoskeleta in spremembe v izražanju specifičnih genov. Eden od glavnih označevalcev zrelih oligodendrocitov je mielinski bazalni protein (angl. myelin basic protein, MBP), katerega izražanje sovpada z napredovanjem v funkcionalno mielinizirajoče celice ³ (Slika 1). V bolezenskih stanjih, kot je multipla skleroza, je sposobnost preživelih OPC, da se diferencirajo v zrele oligodendrocite, pogosto okrnjena ¹. Prepoznavanje novih dejavnikov, ki bi lahko spodbudili ta proces, zato predstavlja eno od ključnih usmeritev sodobne regenerativne nevroznanosti.

Slika 1. Vloga γ-enolaze in njene regulacije s katepsinom X pri diferenciaciji oligodendrocitov. Shema ponazarja procese demielinizacije, diferenciacije in remielinizacije nevronov v osrednjem živčevju. Po poškodbi mielina se oligodendrocitne prekurzorske celice (OPC) začnejo diferencirati v zrele oligodendrocite, pri čemer se izražanje α-enolaze zmanjšuje, izražanje γ-enolaze pa narašča, kar sovpada s povečanim izražanjem mielinskega bazalnega proteina (MBP). Katepsin X z encimsko cepitvijo C-končnega dela γ-enolaze zavira njeno aktivnost, podobno nevrotrofičnim dejavnikom, s čimer lahko vpliva na uspešnost mielinske obnove. (Ustvarili avtorji v programu BioRender.)

Pri diferenciaciji oligodendrocitov in remielinizaciji imajo pomembno vlogo tudi nevrotrofični dejavniki, kot je možganski nevrotrofični dejavnik (angl. brain-derived neurotrophic factor, BDNF), ki prek receptorjev na površini celic spodbuja njihovo diferenciacijo ⁴. Med molekulami, ki izkazujejo nevrotrofično podporo, je tudi izooblika glikolitičnega encima enolaze – γ-enolaza. V možganih sesalcev obstajata dve obliki encima enolaze, in sicer α-enolaza (angl. α-enolase, ENO1), ki je prisotna v različnih vrstah celic, in γ-enolaza (angl. γ-enolase, ENO2), ki je značilna predvsem za nevronske celice (Slika 2). Med razvojem in diferenciacijo nevronov pride do spremembe v izražanju izooblik enolaze, pri čemer α-enolazo postopno zamenja γ-enolaza, ki prevzame pomembnejšo vlogo v specializiranih nevronskih funkcijah ⁵. Nevrotrofična aktivnost γ-enolaze izhaja iz njenega C-končnega dela, ki omogoča vezavo na ogrodni protein γ1-sintrofin in prenos encima k plazemski membrani ⁶, kjer γ-enolaza interagira s tirozin-kinaznim receptorjem, kar sproži signalne poti, ključne za preživetje in diferenciacijo celic ⁷. Trofično delovanje γ-enolaze je odvisno od ohranjenosti njenega C-končnega dela, ki je ključen za aktivacijo signalnih poti. Katepsin X (angl. cathepsin X, CTSX) encimsko cepi C-končni aminokislini in s tem zavira njen biološki učinek ⁸. Čeprav je vloga γ-enolaze pri razvoju nevronov dobro opredeljena, njen pomen v procesu diferenciacije oligodendrocitov in mehanizem uravnavanja s katepsinom X v teh celicah doslej nista bila podrobneje raziskana.

Slika 2. Strukturna shema α-enolaze in γ-enolaze z označenimi funkcijskimi mesti na C-končnem delu. Tridimenzionalni strukturi α-enolaze (levo) in γ-enolaze (desno), prikazani kot dimer z različno obarvanima podenotama (modra in turkizna). V povečavi C-končnega dela (rdeče) sta pri obeh izooblikah označeni cepitveni mesti za katepsin X, kjer proteaza lahko encimsko cepi zadnji dve aminokislini. Le γ-enolaza vsebuje dodatno vezavno mesto za γ1-sintrofin, ki omogoča prenos encima k plazemski membrani in aktivacijo nevrotrofičnih signalnih poti. (Ustvarili avtorji v programu BioRender.)

V nedavni raziskavi smo preverili, ali γ-enolaza spodbuja diferenciacijo oligodendrocitov in ali je ta funkcija uravnavana s proteolitično aktivnostjo katepsina X ⁹. Uporabili smo človeško oligodendroglialno celično linijo HOG, ki omogoča stabilno in ponovljivo preučevanje oligodendrocitne diferenciacije v in vitro pogojih. Diferenciacijo smo spodbudili s protokolom, povzetim iz uveljavljene literature, ki vključuje spremembo gojiščnih pogojev, ter spremljali spremembe v izražanju izooblik enolaze in MBP kot označevalca zrelosti oligodendrocitov. Izvedli smo funkcionalne poskuse s povečanjem in utišanjem izražanja γ-enolaze ter zaviranjem in utišanjem katepsina X.

Izražanje izooblik enolaze med dozorevanjem oligodendrocitov

Rezultati so pokazali, da med diferenciacijo celic HOG pride do značilnega preklopa v izražanju α-enolaze v γ-enolazo, kar je bilo do sedaj pokazano le na nevronskih celicah. S konfokalno mikroskopijo smo opazili, da se α-enolaza izraža v citoplazmi tako nediferenciranih kot diferenciranih celic oligodendrocitov, medtem ko je γ-enolaza prisotna ob plazemski membrani in vzdolž celičnih izrastkov (Slika 3A). Z encimskim imunosorbentnim testom smo kvantitativno analizirali izražanje α- in γ-enolaze v različnih fazah diferenciacije oligodendrocitov. Rezultati so pokazali, da se izražanje α-enolaze med diferenciacijo ne spremeni statistično značilno, nasprotno pa se izražanje γ-enolaze med diferenciacijo povečuje, kar nakazuje njeno vlogo pri uravnavanju dozorevanja oligodendrocitov v mielinizirajoče celice (Slika 3B). V diferenciranih celicah je γ-enolaza postala prevladujoča izooblika, kar je sovpadalo z izrazito povišano ravnjo mielinskega MBP (Slika 3C). Ti podatki kažejo, da je povečano izražanje γ-enolaze povezano z napredovanjem celic v mielinizirajoči fenotip.

Vpliv γ-enolaze na diferenciacijo oligodendrocitov

Da bi ugotovili, ali γ-enolaza deluje le kot spremljevalni pokazatelj diferenciacije ali ima vlogo pri njenem spodbujanju, smo v oligodendrocitih povečali njeno izražanje z vnosom plazmida z zapisom za γ-enolazo. Celice z višjo ravnjo izražanja tega encima so pokazale izrazitejše morfološke spremembe, značilne za zrele oligodendrocite, tj. večjo razvejanost in daljše izrastke, kar smo potrdili s svetlobno mikroskopijo (Slika 3D) in kvantitativno analizo (Slika 3E). Obenem smo z analizo prenosa po westernu pokazali znatno višje ravni MBP (Slika 3F). Nasprotno pa je utišanje gena za γ-enolazo z uporabo male interferenčne RNA zavrlo diferenciacijo, kar se je kvantitativno odražalo v zmanjšani razvejenosti in krajših celičnih izrastkih (Slika 3G) ter znižani ravni izražanja MBP (Slika 3H). Rezultati kažejo, da γ-enolaza ne predstavlja le označevalca diferenciacije, temveč aktivno spodbuja zorenje oligodendrocitov v mielinizirajoče celice.

Uravnavanje trofične aktivnosti γ-enolaze s katepsinom X

Poleg funkcionalne vloge γ-enolaze smo raziskali tudi mehanizme, ki uravnavajo njeno aktivnost. Znano je, da katepsin X cepi C-končni del γ-enolaze, kar prepreči njeno interakcijo z ogrodnim proteinom γ1-sintrofinom, potrebno za aktivacijo trofičnih signalnih poti ⁶. Z namenom preučitve vpliva katepsina X na uravnavanje γ-enolaze v diferenciranih oligodendrocitih smo njegovo delovanje zavrli z dvema pristopoma: z utišanjem izražanja s pomočjo male interferenčne RNA in z uporabo zaviralca proteolitične aktivnosti katepsina X. Morfološko analizo, izvedeno s svetlobno mikroskopijo, smo uporabili za oceno dolžine in razvejenosti celičnih izrastkov (Slika 3I), pri čemer smo v obeh primerih tudi kvantitativno potrdili njihovo izrazito podaljšanje (Slika 3J, 3K), kar je značilno za napredovalo diferenciacijo v mielinizirajoči fenotip. Poleg tega smo s pomočjo analize prenosa po westernu potrdili, da utišanje izražanja katepsina X vodi do povečane ravni aktivne, necepljene oblike γ-enolaze, kar dodatno potrjuje povezavo med delovanjem katepsina X in uravnavanjem aktivnosti γ-enolaze (Slika 3L). Hkrati je bilo zaznano tudi povišano izražanje MBP ob utišanem izražanju katepsina X (Slika 3M), kar dodatno potrjuje napredovanje oligodendrocitov v mielinizirajoče celice.

Slika 3. Vpliv γ-enolaze in katepsina X na diferenciacijo celic oligodendrocitov.(A) Imunofluorescenca za α-enolazo (rdeča, levo) in γ-enolazo (rdeča, desno) v nediferenciranih (zgoraj) in diferenciranih (spodaj) celicah oligodendrocitov. Celična jedra so obarvana z DAPI (modro), puščice označujejo izražanje v izrastkih. Merilo: 10 µm (B) Kvantifikacija izražanja α- in γ-enolaze z encimskim imunosorbentnim testom. (C) Analiza pretočne citometrije izražanja označevalca mielinskega bazalnega proteina (MBP) v nediferenciranih in diferenciranih celicah oligodendrocitov. (D) Fazno-kontrastne slike diferenciranih celic prikazujejo spremembe v morfologiji po nadizražanju γ-enolaze s plazmidom z zapisom za γ-enolazo in utišanju njenega izražanja z malo interferenčno RNA (siRNA). Puščice kažejo na celične izrastke. (E, F) Kvantifikacija dolžine izrastkov diferenciranih celic po nadizražanju (E) in utišanju izražanja (F) γ-enolaze. (G, H) Kvantifikacija izražanja MBP z analizo prenosa po westernu po nadizražanju (G) in utišanju izražanja (H) γ-enolaze. (I) Fazno-kontrastne slike diferenciranih celic prikazujejo spremembe v morfologiji po utišanju izražanja katepsina X s siRNA in zaviranjem proteolitične aktivnosti katepsina X. Puščice kažejo na celične izrastke. (J, K) Kvantifikacija dolžine izrastkov diferenciranih celic po utišanju izražanja (J) in zaviranju proteolitične aktivnosti (K) katepsina X. (L, M) Kvantifikacija izražanja aktivne oblike γ-enolaze (L) in MBP (M) z analizo prenosa po westernu po utišanju izražanja katepsina X. Rezultati so prikazani kot povprečje s standardno napako sredine (SEM) in s statistično značilnimi razlikami (p* < 0,05). Povzeto po ⁹.

Pomen za regeneracijo mielina in terapevtski potencial

Izsledki raziskave kažejo, da γ-enolaza ni zgolj presnovni encim, temveč pomemben dejavnik, ki spodbuja zorenje oligodendrocitov, s čimer neposredno prispeva k nastajanju mielinskega ovoja. Delovanje γ-enolaze pa je tesno povezano s strukturo njenega C-končnega dela, ki je bistven za njeno nevrotrofično delovanje. Slednja predstavlja tarčo lizosomski peptidazi katepsinu X, ki s cepitvijo omejuje nevrotrofični učinek γ-enolaze. Izsledki raziskave imajo pomembne implikacije za razvoj terapevtskih strategij, usmerjenih v obnovo mielina pri nevrodegenerativnih boleznih. Ciljno povečanje ravni aktivne oblike γ-enolaze in zaviranje proteolitičnega delovanja katepsina X bi lahko predstavljala dva komplementarna pristopa za spodbujanje remielinizacije nevronov pri boleznih, kot je multipla skleroza.

Zaključek

Raziskava predstavlja prvi eksperimentalni dokaz, da γ-enolaza aktivno prispeva k diferenciaciji oligodendrocitov in tvorbi mielina, pri čemer je ta učinek uravnavan z encimsko aktivnostjo katepsina X. Ugotovitve dopolnjujejo razumevanje molekularnih mehanizmov mielinizacije in nakazujejo nove možnosti za ciljno zdravljenje bolezni, povezanih z demielinizacijo. Nadaljnje raziskave v naprednejših modelih, kot so tridimenzionalne celične kulture ali možganski organoidi, bodo ključne za potrditev teh mehanizmov v fizioloških in patoloških pogojih ter za proučevanje terapevtskih učinkov za namen morebitne klinične uporabe.

Raziskavo je financirala Javna agencija za znanstvenoraziskovalno in inovacijsko dejavnost Republike Slovenije (P4-0127).

Povezava do objave: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S014181302501013X